南京医科大学学报(自然科学版)

作者：钱宝梅,王文博,罗 灿,张 婧,赵 聃,王迎伟,邱 文

单位：南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166,

关键词：巨噬细胞炎性蛋白⁃1α（MIP⁃1α）;干扰素调节因子⁃8（IRF⁃8）;启动子

基金：国家自然科学基金（31470853，81471626）；南京医科大学优秀中青年教师支持计划

目的：构建大鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）基因启动子（全长和截短）荧光素酶报告质粒，并观察在人胚肾细胞（HEK-293T）中过表达干扰素调节因子-8（interferon regulatory factor-8，IRF-8）对MIP-1α基因启动活性的影响，同时筛选其可能的IRF-8结合元件。方法：采用PCR技术，扩增出大鼠MIP-1α基因启动子序列，将MIP-1α基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，构建MIP-1α基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3-MIP-1α-FL）。将上述pGL3-MIP-1α-FL和本课题组已构建的大鼠IRF-8过表达质粒（pIRES2-IRF-8）共转染HEK-293T细胞，检测细胞内荧光素酶活性，确定IRF-8对MIP-1α基因的启动作用。同时，应用生物信息学软件预测MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件，并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒（pGL3-MIP-1α-1~3）。将上述MIP-1α基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-8过表达质粒共转染HEK-293T细胞，再测定荧光素酶活性，初步确定IRF-8的结合元件。结果：菌液PCR及核酸测序证实，上述pGL3-MIP-1α-FL（-1 400~+94 nt）质粒构建成功。将pGL3-MIP-1α-FL和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现，过表达IRF-8可显著增加MIP-1α基因启动子活性。应用生物信息学软件预测发现MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件（-1 157~-1 144nt、-740~-734 nt、-683~-670 nt、-365~-359 nt、-249~-236 nt），并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒，即pGL3-MIP-1α-1（-453~+94 nt）、pGL3-MIP-1α-2（-352~+94 nt）和pGL3-MIP-1α-3（-3~+94 nt）。将pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1~3和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现，pGL3-MIP-1α-3的启动活性显著低于pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1和pGL3-MIP-1α-2。提示IRF-8可能结合在大鼠MIP-1α基因启动子的-352~-3 nt区域的IRF-8结合元件（-249~-236 nt）上。结论：本实验成功构建了大鼠MIP-1α基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒，并初步筛查出IRF-8在MIP-1α基因启动子上的可能结合元件，为后续研究奠定了基础。

来源：2019年第1期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

查看南京医科大学学报(自然科学版)杂志2019年第1期