南京医科大学学报(自然科学版)

作者：廖军义,杜婷婷,黄 伟,何通川,徐 伟

单位：重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016,,重庆市第七人民医院内分泌与肾病科，重庆 400054,,重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016,,芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室，伊利诺伊州 芝加哥 60637，美国,,重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016,

关键词：Notch1受体胞内结合域;重组腺病毒;Notch信号通路

基金：国家自然科学基金面上项目（81371972，81572142）；重庆市科委基础研究与前沿探索项目（cstc2018jcyjAX0088）；重庆市研究生科研创新项目（CYB15098）；重庆医科大学附属第一医院院内培育基金资助项目（2018PYJJ?11）

目的：构建Notch1受体胞内结合域（Notch1 intracellular domain，NICD1）的重组腺病毒AdNICD1，探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法：利用高保真PCR（high fidelity PCR，Hi-Fi PCR）扩增NICD1编码区，并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中，经过菌落PCR、测序鉴定后，在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，再次通过质粒PCR鉴定，然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞（human embryo kidney 293 cell line，HEK293）中进行包装，收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞（immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells，iMAD），检测病毒感染效率；通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况；利用Western blot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果：成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD；利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达，并激活Notch信号下游基因的表达。结论：成功构建过表达NICD1的重组腺病毒，并有效激活Notch信号通路。

来源：2019年第3期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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