南京医科大学学报(自然科学版)

作者：王文博，钱宝梅，罗 灿，彭明玉，张 婧，赵 聃，王迎伟，邱 文，季明德

单位：南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166,,江苏省中医院检验科，江苏 南京 210006,

关键词：核因子⁃κB p65（NF⁃κB p65）;干扰素调节因子⁃8（IRF⁃8）;启动子;结合元件

基金：国家自然科学基金（31470853，81603358，31770934，81971468）

目的：探讨大鼠核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子-8（interferon regulatory factor-8，IRF-8）基因启动的影响，并初步筛查IRF-8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding，CDS）序列，将其插入到空载pIRES2-EGFP质粒中，构建大鼠野生型（wild type，WT）p65过表达质粒（pIRES2-p65 WT）。在此基础上，将p65第535位丝氨酸（serine，S）突变为天冬氨酸（aspartic，D）或丙氨酸（alanine，A），分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2-p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2-p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF-8基因启动子区p65的结合元件，并据此构建IRF-8启动子全长（full-length，FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒，即pGL3-IRF-8-FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3-IRF-8-1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3-IRF-8-2（-752 ~ +174 nt）和pGL3-IRF-8-3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T，HEK-293T）细胞，Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF-8的启动子活性，并分析IRF-8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2-p65 WT、pIRES2-p65 S535D、pIRES2-p65 S535A和pGL3-IRF-8-FL共转染HEK-293T，发现过表达pIRES2-p65 WT或pIRES2-p65 S535D均可明显增加IRF-8启动子活性，且以pIRES2-p65 S535D更为显著；而过表达pIRES2-p65 S535A后，IRF-8启动子活性无明显变化。将pGL3-IRF-8-FL、pGL3-IRF-8-1~3和pIRES2-p65 S535D共转染HEK-293T后发现，pGL3-IRF-8-3的启动子活性显著低于pGL3-IRF-8-FL、pGL3-IRF-8-1和pGL3-IRF-8-2，提示大鼠IRF-8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK-293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF-8基因的启动，且p65与IRF-8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。

来源：2020年第5期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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