南京医科大学学报(自然科学版)

作者：陈红全，王建瑛

单位：浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州 310016；南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166,

关键词：CRISPR/Cas9;PiggyBac转座子;可诱导表达;文库筛选

基金：南京医科大学自然科学基金（NMUB2019033）

目的：利用PiggyBac转座子系统，构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，并针对人核受体基因构建sgRNA文库，进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体，与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中，通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系；构建核受体基因sgRNA病毒文库，并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系，筛选对顺铂具有抵抗性的克隆，并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株，在5个基因位点上可以进行高效编辑；感染sgRNA文库之后，挑选顺铂耐药的克隆，并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA，经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统，构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑，并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。

来源：2021年第10期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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