南京医科大学学报(自然科学版)

作者：朱晓晗，刘晓蕊，李 琳，王 盈，杨海元，戴一凡

单位：南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166,

关键词：血友病乙;F9;CRISPR/Cas9;FⅨ

基金：国家自然科学基金（81970164，81874144）

目的：利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维（porcine fetal fibroblast，PFF）细胞系，为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法：首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析，模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性；其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点，利用CRISPR在线靶点设计工具（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html）设计并合成单链向导 RNA（single guide RNA，sgRNA），以pX330质粒为骨架构建打靶载体，同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中，经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆，测序并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离，FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%，三维结构的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞，药筛后共获得55个单细胞克隆，经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变，计算敲除率为45.5%。结论：人和猪F9基因具有高度同源性；构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆，为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。

来源：2022年第1期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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