南京医科大学学报(自然科学版)

作者：金霄，陈晓林，姚静，杜兴冉，颜海豪，李国莉，冯旰珠

单位：南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210011,,南京医科大学附属逸夫医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 211166,,南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210011,,南京医科大学附属江宁医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 211100,,南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210011,,江苏省疾病预防与控制中心慢性传染病防治所，江苏 南京 210009,,南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210011,

关键词：结核分枝杆菌;差异区域;Rv2647蛋白;噬菌体重组技术;肺组织损伤

基金：国家自然科学基金（82070017）

目的：通过噬菌体重组技术分别构建结核分枝杆菌Rv2647基因的敲除株和回补株以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms），评估结核分枝杆菌Rv2647蛋白对模型鼠肺组织的损伤效应。方法：构建同源交换位点并整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组，获取噬菌粒并将其导入Ms，构建具有同源交换位点的重组噬菌体。体外扩增获得高滴度重组噬菌体并转染结核分枝杆菌（H37Rv），37 ℃静置培养 28 d，挑取单克隆进行 PCR 验证，获得 Rv2647 基因敲除株 （H37RvΔRv2647）。PCR 扩增Rv2647基因并通过无缝克隆分别将其整合到载体pMV361和pMV261多克隆位点处，获得阳性质粒后分别电转化H37RvΔRv2647和Ms，获得结核分枝杆菌回补株（H37RvΔRv2647：：Rv2647）及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Ms：：Rv2647）。分别以H37Rv、H37RvΔRv2647、H37RvΔRv2647：：Rv2647、Ms及Ms：：Rv2647的菌液经气管攻击C57BL/6小鼠，分别比较 H37Rv（30 d）与 Ms（7 d）模型鼠的存活率、肺组织细菌负荷及肺组织病理损伤程度。结果：PCR 结果显示， H37RvΔRv2647 中 Rv2647 基因缺失，而 H37RvΔRv2647：：Rv2647 及 Ms：：Rv2647 中 Rv2647 基因皆存在。H37RvΔRv2647、 H37Rv及H37RvΔRv2647：：Rv2647组模型鼠30 d存活率分别为100.00%、83.33%及83.33%；Ms和Ms：：Rv2647组模型鼠的7 d 存活率分别为100.00%和83.33%；H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织细菌负荷（lgCFU）为（3.40±0.18），显著低于H37Rv组（3.86± 0.15，P ＜ 0.001）和H37RvΔRv2647：：Rv2647组（3.80±0.16，P ＜ 0.01）；H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织炎症面积（%）为（4.37± 3.06），显著低于H37Rv组（62.76±14.24，P ＜ 0.001）和H37RvΔRv2647：：Rv2647组（67.37±0.45，P ＜ 0.001）；Ms组模型鼠肺组织 lgCFU为（2.53±0.16），显著低于Ms：：Rv2647组（2.81±0.13，P ＜ 0.01）；Ms组模型鼠肺组织炎症面积（%）为（5.71±1.29），显著低于 Ms：：Rv2647 组（33.13±13.84，P ＜ 0.05）。结论：成功构建了结核分枝杆菌 Rv2647 基因敲除株（H37RvΔRv2647）及回补株 （H37RvΔRv2647：：Rv2647）以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Ms：：Rv2647）。Rv2647蛋白可能通过抑制宿主对结核分枝杆菌的清除，加重了模型鼠肺组织病理损伤。

来源：2024年第11期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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