南京医科大学学报(自然科学版)

作者：黎燕，周克茹，季旻珺，王桂芹

单位：南京医科大学病原生物学系，江苏 南京 211166,,中科南京生命健康高等研究院，江苏 南京 211135,,南京医科大学病原生物学系，江苏 南京 211166,,中科南京生命健康高等研究院，江苏 南京 211135,

关键词：季节性流感;H1N1;反向遗传学技术

基金：江苏省“双创人才”项目（JSSCRC2023555）；江苏省重点研发计划（BE2021756）

目的：利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09病毒，评价其在MDCK细胞和鸡胚内的生长特性以及对BALB/c 小鼠的致病性。方法：RT-PCR技术扩增A/Puerto Rico/8/1934（简称PR8）病毒基因片段，并克隆至pHW2000双向表达载体上。全球共享流感数据倡议组织（global initiative of sharing all influenza data，GISAID）数据库中下载A/Wisconsin/588/2019（H1N1） 的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）序列，将其HA非编码区替换为A/California/07/2009（H1N1）的 HA非编码区。全基因合成A/Wisconsin/588/2019的HA和NA片段，分别克隆至pHW2000双向表达载体上。将PR8病毒6个内部基因重组质粒与A/Wisconsin/588/2019的HA和NA重组质粒共转染293T细胞与MDCK细胞，拯救重组病毒。对重组病毒进行血凝效价测定和RT-PCR鉴定以判断是否拯救成功。将重组病毒接种MDCK细胞和9~10日龄鸡胚，评价其生长特性并绘制生长曲线。将重组病毒以滴鼻方式感染BALB/c小鼠，记录小鼠体重变化和生存率以评价其致病性。结果：成功拯救出重组 A/Wisconsin/588/2019病毒，血凝效价为1∶8，测序鉴定其HA和NA序列与预期一致，重组病毒接种MDCK细胞后72 h，大部分细胞完全脱落，病毒滴度为105.38TCID50/mL，复制高峰期为接种后60 h，接种鸡胚后的血凝效价最高可达1∶28 。重组病毒（病毒稀释比为1∶1）滴鼻BALB/c小鼠后第8天，小鼠全部死亡，对小鼠的半数致死剂量为10-1.38/50 μL。结论：成功拯救一株重组H1N1 pdm09病毒，该病毒在MDCK细胞上生长良好且具有良好的鸡胚适应性，对小鼠具有致病性和致死性，为反向遗传学技术快速拯救流感病毒提供新思路。

来源：2025年第3期

《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊编辑部

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